Analytica Special - Best practices for quantitative real-time PCR (qPCR)

Eintägiges Seminar
ID: PCR-M

Analytica Special
Kombinieren Sie Ihren Besuch auf der Analytica 2022 mit einer Fortbildung zu spannenden Labor- und Analytik-Themen.
Mit der Buchung eines unserer Analytica Specials erhalten Sie zwei Tageskarten für den Besuch der Analytica 2022 gratis. Zusätzlich bieten wir Ihnen die An- und Abreise mit der Bahn zu einem günstigen Festpreis an. Sie erhalten mit unserer Anmeldebestätigung einen Link zur Deutschen Bahn, mit dem Sie die Bahnreise buchen können. Preise und Details finden Sie hier:

Teilnahmebedingungen:
Alle Informationen zu Reservierung, Buchung, Veranstaltungsunterlagen und Teilnahmebescheinigung finden Sie in unseren Teilnahmebedingungen für offene Veranstaltungen.

Zielgruppe

Für wen ist das Seminar interessant

- Technische und wissenschaftliche Mitarbeitende aus der akademischen, industriellen und klinischen Forschung.
- Mitarbeitende aus der Qualitätskontrolle und Assayentwicklung, die nukleinsäure-basierte Verfahren anwenden.

Lernziele

Nach dem Seminar

- haben Sie die Grundlagen einer quantitativen PCR aufgefrischt und die Besonderheiten, Stärken und Schwächen der Messtechnik erhalten.
- haben Sie gelernt, wie ein qPCR Assay designed, etabliert und validiert wird.
- sind Ihnen Beispiele für typische Fehlerquellen sowie deren Lösungen bekannt und Sie sind in der Lage diese Lösungsansätze in Ihr Labor zu übertragen.
- haben Sie einen Überblick über gängige Methoden zur Datenauswertung, die anhand von Rechenbeispielen vertieft wurden, erhalten.

Inhalte

qPCR Grundlagen

Funktionsprinzip einer qPCR
Vergleich PCR (Northern Blot), qPCR mit Stärken und Schwächen
Funktionsprinzip der verschiedenen Detektionsreagenzien (Farbstoff, Sonde)
Anwendungsfälle einer qPCR mit kurzen Beispielen anhand von Kundenfällen
Wo macht es Sinn, wo nicht?
Gängige qPCR-Geräte und -Verbrauchsmaterialien
Typische Kosten eines qPCR-Assays
Kostenvergleich mit End-Punkt PCR, NGS
qPCR-Parameter
Phasen, Cq, Fluoreszenz
Schmelzkurven
Wie und warum?
Wie werden Proben miteinander verglichen?

qPCR Assay Design

Wie designe/etabliere ich einen qPCR-Assay?
Worauf muss ich bei einer reversen Transkription achten?
Primer, Amplikons
Multiplexing
Notwendige Kontrollen
Referenzgene - How To
Protokoll und Handling eines qPCR-Assays
1-Step vs. 2-Step qPCR

qPCR Assay Validation

Was sagen uns die Kontrollen?
Welche qPCR-Parameter kann ich als Qualitätskontrolle des Assays verwenden?
Linear Dynamic Range und Primer Efficiency
Ist ein Agarosegel zur Assayvalidierung notwendig?
Darf man Reagenzien innerhalb einer Versuchsreihe austauschen?

qPCR Troubleshooting (Beispiele, Modelle)

PCR-Inhibition
Welchen Einfluss hat die DNA/cDNA Konzentration?
Replikate (technisch/biologisch)
Niedrige Fluoreszenzwerte/Baseline
Was sagen Schmelzkurven über die Assayqualität?
Welcher Einfluss hat die Primer Konzentration?

Daten Analyse

Verfügbare Software
Strategien / Modelle zur Datenauswertung
PCR-Effizienz pro Reaktion berechnen
ddCt
Relative Quantities
Effizienzkorrektur
ddCt vs. Relative Quantities